免疫組化抗體

免疫組化抗體，是應用免疫學基本原理--抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑(螢光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細胞內抗原(多肽和蛋白質)，對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學技術(immunohistochemistry)或免疫細胞化學技術(immunocytochemistry)。

免疫組化抗體，是應用免疫學基本原理——抗原抗體反應，免疫組化免疫組化即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑（螢光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細胞內抗原（多肽和蛋白質），對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學技術(immunohistochemistry)或免疫細胞化學技術(immunocytochemistry)。

免疫組化抗體作用實驗所用的標本實驗所用主要為組織標本和細胞標本兩大類，前者包括石蠟切片（病理切片和組織晶片）和冰凍切片，後者包括組織印片、細胞爬片和細胞塗片。其中石蠟切片是製作組織標本最常用、最基本的方法，對於組織形態保存好，且能作連續切片，有利於各種染色對照觀察；還能長期存檔，供回顧性研究；石蠟切片製作過程對組織內抗原暴露有一定的影響，但可進行抗原修復，是免疫組化中首選的組織標本製作方法。實驗所用的抗體免疫組化實驗中常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體，單克隆抗體是一個B淋巴細胞克隆分泌的抗體，應用細胞融合雜交瘤技術免疫動物製備。多克隆抗體是將純化後的抗原直接免疫動物後，從動物血中所獲得的免疫血清，是多個B淋巴細胞克隆所產生的抗體混合物。

操作步驟一 免疫組化（LP 法）操作步驟1． 切片常規脫蠟至水。如需抗原修復，可在此步後進行⒉ 緩衝液洗 3min/2 次。⒊ 為了降低內源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色，將切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分鐘。⒋ 緩衝液洗 5min/2 次。⒌ 滴加 Ultra V Block ， 在室溫下孵育 5 分鐘以封閉非特異性的背景染色。（注：孵育不要超過 10 分鐘，否則會導致特異性染色降低。如果一抗的稀釋液中含有 5 － 10% 正常羊血清，這一步可以省略。）⒍ 緩衝液洗 5min/2 次。⒎ 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小時。（具體孵育時間和溫度由試驗者最終決定）⒏ 緩衝液洗 5min/2 次。9 ． 滴加 Primary Antibody Enhancer（增強子），在室溫下孵育 20 分鐘。10 ．緩衝液洗 5min/2 次。11 ．滴加 HRP Polymer（酶標二抗） ，在室溫下孵育 30 分鐘。（注：HRP Polymer 對光敏感，應避免不必要的光暴露並儲存在不透明的小瓶中。）12 ．緩衝液洗 5min/2 次。13 ．向 1ml DAB Plus Substrate （或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen），混勻後滴加到切片上，孵育 3 － 15 分鐘。（具體時間由染色深淺決定。）14 ．自來水充分沖洗，複染，脫水，透明，封片。

二．免疫組化操作步驟⑴、石蠟切片脫蠟至水。⑵、 3%H 2 O 2 室溫孵育 5-10 分鐘，以消除內源性過氧化物酶的活性。⑶、蒸餾水沖洗， PBS 浸泡 5 分鐘 x2 （如需抗原修復，可在此步後進行）。⑷、 5-10% 正常山羊血清（PBS 稀釋）封閉，室溫孵育 10 分鐘，傾去血清，勿洗。滴加 一抗 工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小時或 4 ℃ 過夜。⑸、 PBS 沖洗， 5 分鐘 x3 次。⑹、滴加適量 生物素標記二抗 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鐘。⑺、 PBS 沖洗， 5 分鐘 x3 次。⑻、滴加適量的 辣根酶或鹼性磷酸酶標記的鏈黴卵白素 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分鐘。⑼、 PBS 沖洗， 5 分鐘 x3 次。⑽、顯色劑顯色 3-15 分鐘（DAB 或 NBT/BCIP）⑾、自來水充分沖洗，複染，脫水，透明，封片。三. 免疫組化染色步驟冰凍切片 4-8um ，室溫放置 30 分鐘後，入 4 ℃丙酮固定 10分鐘，PBS洗，5分鐘x3，用過氧化氫孵育5-10分鐘，消除內源性過氧化物酶的活性。