丙酮酸鈉的作用，兩個作用早瞭解

2017-03-27

丙酮酸鈉是溶于水，加入氫氯化鈉之後會出現中和反應，加入乙醇會出現丙酮酸鈉結晶。一般來說丙酮酸鈉需要儲存於陰涼、通風的庫房，遠離火種、熱源等等。

一、液體配製

1.胰蛋白酶液(0.25%)

2.稱取所需胰蛋白酶2.5g

3.加入無Ca2+、Mg2+液體(D-Hanks液)1000ml

4.磁力攪拌混勻，使其完全溶解

5.過濾、除菌、分裝備用

6.D-Hanks液

7.準確稱量NaCl 8.00g、KCl 0.40g、Na2HPO4.H2O 0.06g、KH2PO4 0.06g、NaHCO30.35g;

8.依次將各成分溶解於800ml三蒸水中。溶解時必須待一種試劑完全溶解後，再加入下一種試劑，直至所有試劑溶解後混勻;

9.酚紅用5.6%NaHCO3將之溶解;

10.補加水至1000ml混勻;

11.分裝鹽水瓶內， 8磅10～20min高壓蒸汽消毒滅菌， 4℃冰箱內保存備用。

12.用水配製7.4% NaHCO3溶液，過濾除菌，分裝備用;

13.用無菌NaHCO3溶液調節Hanks液pH值7.2～7.4。

14.以去離子水稀釋DNA酶Ⅰ至200 u/ml,過濾除菌備用。

15.90%Percoll: (9份Percoll:1份9.0% NaCl)

16.DMEM-H-G:(DMEM培養液、25mM HEPES、25mM葡萄糖)

17.台盼藍液：稱取4g台盼藍，加少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100ml，用濾紙過濾， 4℃冰箱內保存備用，使用時以PBS稀釋至0.4%。

二、滋養層細胞分離純化實驗方法

取剖腹產術後的無菌胎盤組織，在無菌條件下剪取蛻膜層與羊膜層之間的絨毛組織，以無菌生理鹽水反復洗滌三次，修剪以去掉連接的組織、血管等得到柔軟的絨毛，大約30g。將絨毛組織剪碎至1～3mm3，並盡可能去除肉眼可見的小血管及纖維連接成分。

1.胰蛋白酶消化

將絨毛剪碎至2～3mm3左右的小塊;

100mL 0.25%胰蛋白酶、15U/ml DNA酶Ⅰ37℃消化30min，每隔5～10min搖動一次;

(吹打)消化產物， (吸取消化液)經100目不銹鋼篩網過濾後，濾液加入50ml離心管內(加入10%FCS)， 1000rpm/min離心5min，棄上清;

以含20%胎牛血清DMEM培養液重懸沉澱;(37℃孵箱中)

2.未消化組織重複消化兩次;

收集三次細胞懸液，調整細胞濃度至1×106/ml(不必非常嚴格，只要不是過少)，鏡下檢查細胞呈單個細胞分佈。

此時可接種至培養瓶中培養，如果有細胞成活繼續以下實驗，便於分析原因。

3.Percoll等密度梯度沉降法分離得到純滋養層細胞

製備密度梯度用9.0%NaCl與Percoll以1：9混合，以達到生理性滲透壓，再以0.9%NaCl稀釋為45%和35%兩個濃度，按濃度從大到小將兩個不同密度的Percoll溶液逐層緩慢加入10ml離心管內，每個濃度3ml。

加樣用吸管吸取3ml細胞懸液(含4×107個細胞-----不必非常嚴格)，

小心加在10ml離心管頂層的分離介質上面。

分離室溫下以2500r/min離心20min

離心後分為3部分底層為RBC、少量多形核WBC，頂層為組織連接成分、小血管、絨毛碎片，中層為相對一致的單個核細胞

收集用吸管吸取雲霧狀的中層置於一50ml離心管內， DMEM稀釋4倍， 1000rpm/min離心10min，棄上清，以含20%胎牛血清、100u/ml慶大黴素、25mMol/L HEPES的高糖型DMEM培養液重懸沉澱。

4.細胞培養

將所得的細胞懸液濃度調整至5～6×105/ml，置於培養瓶或預先置有蓋破片的六孔培養板內37℃， 5%CO2孵箱內培養。每24h更換培養液1次。 (第一次換液時用培養液洗兩次，以去除細胞碎片、內源激素;換液之前在倒置相差顯微鏡下檢查細胞貼壁和細胞形態。 )

細胞活力檢測(台盼藍排斥試驗)