諾麗是怎樣抑制腫瘤生長的（美國）

海巴戟(諾麗)果汁對抑制人血管生成和

破壞新生血管網路的作用

美國路易斯安那州立大學健康科學中心

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摘要 ：諾麗果汁，即由海巴戟植物的果實榨取的果汁，被用作藥物已有數個世紀的歷史。我們以人的胎盤血管和人類乳腺腫瘤作為血管生長的外植體來源，運用三維纖維蛋白凝塊矩陣模型對諾麗果汁的效果進行了測試。相比于以生理鹽水作為對照試驗組，5%(體積分數)或更濃的諾麗果汁對胎盤血管外植體上新血管芽生長的抑制作用效果更為明顯。該濃度的諾麗果汁對降低新毛細血管芽的生長速率和增殖速率效果也很顯著。當在血管生長環境下使用濃度10%的諾麗果汁，幾天內即可誘導腫瘤血管與毛細血管網終退化及凋亡。本研究也發現含10%諾麗果汁是人類乳腺腫瘤外植體的血管生長的良好抑制劑。在有血管生長的腫瘤外植體中，10%的諾麗果汁能在2到3天內促使腫瘤血管迅速退化及凋亡。

1 引言

血管生長的定義首先由福克曼在1971年提出，進一步發展了之前關於血管網路生長的理論。在普通成年人體內，血管生長常常與病理過程掛鉤，除復發性增長與排卵期子宮內膜脫落外。在多樣的病理條件下，如視網膜病變、類風濕性關節炎、牛皮癬、傷口癒合、腫瘤生長，原本靜態的血管內皮細胞會隨之轉化為血管生長的表現狀態。曾有人認為，啟動此血管生成“開關”的分子機制是打破了血管內皮生長因數和抑制因數自然的動態平衡狀態。啟動血管內皮細胞生長的“開關”，然後細胞外基質被水解降解，細胞隨之遷移和增殖，進而形成毛細血管結構和彼此交聯的血管網路，任何這些連續步驟的中斷或不通暢都有可能阻止或改善以上病症的出現。為此，目前相關機構正在審查許多能夠作為抗血管生成劑的化合物的功效。另外一種思路由此出現，即阻止血管生長對於新生成實體腫瘤的形成具有重要的抑制作用。這一方法的目標是為了使傳遞給腫瘤細胞的營養中止，導致胂瘤細胞由於營養缺失而發生凋亡。目前已有關於大量化合物，包括長春花生物鹼，秋水仙素，長春花堿，黃酬醋酸( FAA)在中斷腫瘤血管牛長的功效的研究報導，但是它們發揮功效需要較高的濃度，且常常導致病人產生嚴重的副作用。康普瑞汀A4磷酸鹽可以破壞腫瘤血管，同時保留周圍正常的血管組織，儘管周圍血管區域的腫瘤仍然持續生長，但這一現象意味著此藥劑作為佐劑可在常規療法使用。理想情況下，作用於血管系統的抗癌藥物會抑制新的血管生長，從而阻斷腫瘤的擴展和轉移，同時還可攻擊原發腫瘤本身的血管。

海巴戟植株及其果實在南大西洋的島嶼上作為藥用食物已有很長歷史。薩摩亞，大溪地和夏威夷的人們利用海巴戟果汁(諾麗果汁)治療糖尿病，心臟病，高血壓，腎病和膀胱疾病，而其果肉，樹葉和樹皮常常作為膏藥治療瘡口，外傷和膿瘡。近期研究表明，對植入Lewis肺癌細胞的小鼠用諾麗果汁每日進行腹腔注射，能明顯提高小鼠壽命，這一發現說明其對小鼠免疫系統具有刺激作用。其他研究成果表明海巴戟根的氯仿提取物，即一種名為虎刺醛的蒽醌化合物能誘導ras轉化細胞表型的正常化。該研究報導了海巴戟果汁的杭血管生長效果的相關資料。

2 材料與方法

2.1 海巴戟

海巴戟(諾麗)為市售商業化產品。pH值調至7.4，以130 Kgav的轉速離心18h以去除殘留的細胞碎片，並用0. 2μm的Nelgene篩檢程式進行過濾滅菌處理。

2.2血管生長模型

根據路易斯安那州立大學健康科學中心(LSUHSC)內審委員會(IRB)的認可協議，胎盤靜脈血管從匿名志願者的廢棄胎盤中取得。將取出的靜脈血管縱向切開，以使較厚的靜脈組織以平面薄膜的形式充分展現。並利用無菌表皮切割器製造了若干直徑2mm的靜脈盤。這砦靜脈盤之後被放人標準96孔培養板中(康寧公司，紐約康寧)，培養板內已預置入凝血酶溶液(0.05IU，2μl/孔)，並在使用前蒸發乾燥。靜脈盤在3小時內完成預處理過程，以確保內皮細胞的活性。來自不同志願者的靜脈盤在各治療組之間隨機分佈，以減少抽樣誤差。

之後，將靜脈盤覆蓋以100μl血栓介質(HP-VAM)，該介質中含有纖維蛋白原(3毫克/毫升)(Sigma公司，聖路易斯，密蘇里州)和E-己酸(0.5%) (Sigma公司，聖路易斯，密蘇里州)。HPVAM由介質199(美國英傑生命技術公司，馬里蘭州蓋瑟斯堡)，抗生素/抗真菌溶液(100蓽位元青黴素，100單位硫酸鏈黴素和0.25μgβ/mL兩性黴素)(美國英傑生命技術公司，馬里蘭州蓋瑟斯堡)和內皮細胞生長培養基(25%)(美國英傑生命技術公司，馬里蘭州蓋瑟斯堡)製成。將上述物質混合製成凝塊，在6%二氧化碳，94%空氣，37℃條件的可增濕孵化機中進行培養。介質成形後，對含靜脈盤的凝塊補充100μl含20%胎牛血清的HP-VAM，單個板孔液體體積為200μl。

2.3血管生長情況的評估

利用20倍或40倍顯微鏡，以標準化計量網格為參考，進行顯微觀察測量，利用此方法可對所有板孔的血管生長萌芽情況每隔一天進行一次評估。血管生長以兩個標準進行評估。第一，新血管生長比率，以從靜脈盤外周生長的大約長度0.5mm的至少三個血管生長芽的形成為增生界定。基於視覺化評分系統的血管生長指數(AI)是第二個用於在本研究中量化劄管生長的參數。每個靜脈盤分為四個象限，並從0到4對血管生長情況評分。將所有4個象限上的分數累加，並且血管生長指數將以一個範圍為0到16的分數進行描述。這一方法使我們能夠客觀地評價實驗中的各個孔板中血管生長的程度。平均血管生長指數在觀察者組(n=4)之間與治療組之間的相關性很妤(90%或更高)。通過圖像分析評估發現血管平均長度與血管平均生長指數具有較高的相關度。

2.4 血管網的退化

經過7天在HPVAM中的生長，120個血管外植體隨機分為測試組與對照組(每組各60個孔板)。60個孔板用含10%的諾麗果汁處理，另60個對照組孔板則用含10%的0.15摩爾氯化鈉溶液處理。所有孔板都補充了新介質(包含10%諾麗果汁或10%氯化鈉)並每隔兩天評估一次血管生長的情況。在實驗結束時，諾麗處理組和對照組的活性也將進行以網唑翁鹽為基礎的檢測(MTT法測定活性套件，普洛麥格公司，麥迪森，威斯康辛)。

2.5細胞凋亡

我們利用S7100 ApopTag過氧化物檢測試劑盒(Intergen公司，帕切斯，紐約)對10個海巴戟處理組和10個對照組血管外植體進行程式性細胞死亡，即細胞凋亡的檢測。這一試劑盒的工作原理是基於檢測DNA片段的末端標記法(TUNEL)，利用末端去氧核苷酸轉移酶(TdT)將單鏈或者雙鏈DN游離的3'-OH末端進行酶標記。我們可以發現，在細胞核破碎和細胞發生凋亡時，3'-OH端被標記的DNA數量明顯增加。然後可以用抗地高辛過氧化物酶檢測地高辛標記的DNA。簡而言之，組織外植俸以10%福馬林處理，並固定於石蠟中製成石蠟切片，之後用去除石蠟的切片用蛋白酶K(20μg/mL.Oncor公司)處理15分鐘。內源性過氧化氫酶用含2%過氧化氫的PBS溶液處理15分鐘，然後漂洗切片，再用平衡緩衝液處理15秒，清除過量的平衡液，並立即加入末端去氧核苷酸轉移酶，將載玻片置於37℃溫箱中進行孵育。停止加入洗滌緩衝液，再另外孵育10分鐘，並將切片在PBS中洗滌3次，再用兩滴抗地高辛過氧化物酶溫育30分鐘。載玻片用PBS洗滌3次，切片用DAB處理4-6分鐘。之後載玻片用蘇木精複染，在二甲苯中脫水，並進行顯微觀察。

圖1隨著時間推移，血管網路生長情況。圖(A)顯示，在可拎的條件下增殖進行一周的情況(20倍放大)。圖(B)顯示，在呵控的條件下增殖進行兩周的情況(20倍放大)。圖(C)顯示，血管網路形成的圖像(40倍放大)。

2.6資料

諾麗處理組與對照組利用t檢驗法進行檢驗比較。資料符合t檢驗法的假設。所有統計檢驗均為雙側檢驗。

3 結果

本研究顯示胎盤靜脈外植體的血管在實驗開始後的第24天開始生長。雖然是在控制條件下，外植體生長的血管數目不同，但大多數起始率都可達70-95%，少數起始生長率低70%外植體可以忽略不計。圖1證實了在兩周時間內胎盤外植體的血管生長和生長是可控的。

圖2 (A)不同濃度的諾麗果汁對人胎盤靜脈外植體的血管生成的抑制效果。諾麗果汁在130Kgav下進行離心，通過一個0.2微米濾孔的濾器過濾，酸鹼度調整為7.4。所有諾麗賓驗的代表資料來自于不同諾麗濃度的3個胎盤上面的60個外植體。通過控制使介質處於同樣的體積(2.5%，5%，10%)，添加0.15摩爾的氯化鈉以保證觀察結果不受營養介質多樣性的影響。在圖中的控制點代表添加5%的氯化鈉。2.5%的對照對比2.5%諾麗P=ns; 5%的對照對比5%諾麗P<><>

圖3 (A)諾麗果汁抑制血管生成網路的情況。在l00%的生長介質中培養七天，在生長介質中添加10%的諾麗果汁處理來自於三個胎盤的30個外植體;在生長介質中，來自於同一個胎盤的30個可控的外植體用10%的氯化鈉處理。所有介質的酸鹼度應平衡到7.4。介質每兩天更換一次，同時進行計數。兩種處理的差異是十分顯著的，P<>

諾麗果汁的劑量效果是通過測試各種諾麗濃度抑制血管生長和血生長的療效而得出的。圖2顯示，當在5%和10%的諾麗果汁中添加生長介質時，諾麗對抑制血管生長具有較高的效率，而濃度為2.5%的諾麗果汁則失去抑制血管生長的效果，但是在培養基中添加2.5%的諾麗果汁卻可以有效地(P=0.005)降低毛細血管的生長和擴散速率(儘管諾麗含量小於5%和10%)，參見圖2B。

將胎盤外植體培養一周，然後置於10%的諾麗果汁中或10%的氯化鈉HPVAM中，以觀察諾麗對抑制血管生長及破壞血管網方面的效果(圖3A和3B)，10%的氯化鈉作為塒照組實驗，其不會財血管的生長產生任何抑制作用。利用MTT法進行分析，處理實驗組顯示為深藍色，表明諾麗處理過的小孔中細胞發生凋亡。此外，大多數實驗結果顯示諾麗處理之後血管完全退化，且觀察不到血管的生長(見圖3A)。而在外植體中，諾麗處理七天之後，血管組織雖然保持存活狀態，但其形態大為減小，血管網路的複雜程度也大為降低(圖3B)。血管退化是由其細胞凋亡過程中產生的一個類似於球形的小泡導致的(圖4和5)。使用TUNEL實驗(參照“實驗材料與方法”)，我們發現用10%的諾麗培養基處理，可以在很大程度上可以誘導細胞凋亡(表1)。

人類乳腺癌外植體置於l0%的諾麗培養基培養兩周，與對照實驗組相比，諾麗處理組人類乳腺癌外植體的生長率明顯下降(圖6A)。此外，與對照實驗組相比諾麗處理組外植體血管生長的發生率顯著降低(P=0.009)(P=0.02，圖6B)。

圖4諾麗對已建立起來的毛細血管網路的作用呈現在以上三個圖中。圖(A)顯示的是一周內在可控的環境下毛細血管的生長(2倍放大)。(B)顯示的是在同一外植體上，經過7天10%諾麗果汁的處理效果(20倍放大)。(C)是一個B圖局部的放大，證實血管網的降解是十分明顯的(40倍放大)。

圖5這兩張圖顯示的是10%的諾麗果汁處理七天之後誘導細胞凋亡的結果，圈A顯示血管牛長外植體上，圖B是在10%的NaCl HPVAM環境中繼續生長到完傘成形的血管網路(40倍放大)。

4討論

通過本研究可證實海巴戟的果汁有以下功效：(1)在人類胎盤的靜脈外植體中抑制新血管的生長;(2)降低毛細血管的增殖率及靜脈盤血管網路的生長;(3)在新形成的血管網路中誘導細胞凋亡;(4)在人類乳腺癌外植體中抑制血管發生和血管發育。與之前的研究(腹腔注射的諾麗果汁可抑制小鼠體內Lewis肺癌細胞外植體的增殖)相反，本研究發現諾麗在血管增殖的過程中沒有表現啟動免疫系統的功能，因而白細胞未在人類靜脈盤中培養出來。該效果沒有表現出與虎刺醛類似的生理功能，正如我們發現諾麗的氯仿抽提物對血管生長無抑制作用一樣(資料尚未報導)。

雖然可從現在得到的實驗結果看出，諾麗果汁能夠誘導細胞凋亡，這意味著臨床治療中使用諾麗會減少的血管網的形成，很可能依賴于一個完全不同的機制以阻斷血管的生成，其中包括：降解蛋白質水解基質;內皮細胞的增殖;內皮細胞的遷移;毛細血管的生成;血管網路的吻合可能抑制血管生成。我們發現，如圖1所示，在培養基中加入2.5%的諾麗果汁，對阻斷血管生成沒有效果(圖IA)，但對血管的生長有重要的作用(圖1B)。在我們前期研究中已弄清了諾麗中的抗血管生成的組分，發現活性分子既不是蛋白質也不是脂類物質，但當用偏高碘酸鈉降解碳水化合物分子時，其可以發揮阻止諾麗對血管生成的效果(資料未顯示)。

圖6 (A)為人類乳腺腫瘤，34個一毫米的外植體在96孔板上進行培養，分成一個控制群(n=17)，用HPVAM+ 10% NaCI進行培養，測試組用HPVAM+ 10% Noni培養。兩組介質均將pH值調至到7.4，並過濾除菌。不同處理手段和控制群差異是罹著的，P=0.006，使用Wilcoxon標記測試法測定。(B)是人類乳腺腫瘤，34個一毫米的外植體在96孔板上進行培養，分成一個控制群(n=17)，用HPVAM+ 10% NaCl進行培養，測試組用HPVAM+ 10% Noni培養。兩組介質均將pH值調至到7.4，並過濾除菌。小同處理手段和控制群差異是顯著的，P=0. 002

經過七天的處理，外植體被固定、切片、使用TUNEL實驗檢測細胞凋亡，使用蘇木精進行複染色。在玻片上的三個隨機區域進行細胞凋亡檢測(過氧化物酶染色)和細胞核完整性檢測(蘇木精染包)。

正如前面所提到的那樣，內皮細胞可以靜止或啟動的狀態存在。另一項研究顯示內皮細胞的流動狀態

表1在HPVAM中進行七天培養，去除生長介質，10個外植體在HPVAM和10%氯化鈉的混合物中培養，10個其他的外植體在含有10%諾麗的HPVAM中培養的效果。

可以決定它們誘導細胞凋亡的敏感性。有一例實驗就是內皮細胞通過蛋白酶抑制劑來誘導細胞的凋亡，內皮細胞增殖需要340倍的低濃度蛋白酶體抑制劑PSI以誘導細胞的凋亡17%。如果諾麗治療產生的誘導細胞凋亡的機制類似于毛細血管處於匯合的狀態內皮細胞，腫瘤已經建立的血管網可能能夠抵抗諾麗的治療，這將使諾麗能夠有效地阻止新的血管的生成，而保留完整的成熟血管。然而，新形成的毛細血管的易感性如圖3和圖4所示，在新形成的血管網路，如腫瘤血管網中，存在高濃度的血管生長因數，血管內皮細胞很可能存在於有助於促進血管生成的環境中，從而增加了細胞凋亡誘導劑，正如諾麗的治療效果。

諾麗抗血管生成功效的一種可能的機制，是通過與細胞表面的結構，如αv整合素的相互作用。另一項研究顯示，血管生成可能受多種多樣的細胞因數所誘導，可以與至少兩個不同的整合素介導的血管生成途徑相關。諾麗可在碳水化合物等活性成分存在下，與某些生長因數相聯合發揮萁競爭性抑制劑作用。最近的研究結果表明，有許多細胞因數的糖分子識別域及生物活性依賴於與碳水化合物的結合。由此可以推斷整合素的拮抗劑可通過誘導新生血管細胞的死亡，進而促進腫瘤的消退。而這是否是諾麗真正的作用機制，目前仍在積極的研究過程中。

(選自英國《血管生成》，6：143 149。)