丙酮酸鈉的作用,兩個作用早瞭解
丙酮酸鈉是溶于水,加入氫氯化鈉之後會出現中和反應,加入乙醇會出現丙酮酸鈉結晶。一般來說丙酮酸鈉需要儲存於陰涼、通風的庫房,遠離火種、熱源等等。
一、液體配製
1.胰蛋白酶液(0.25%)
2.稱取所需胰蛋白酶2.5g
3.加入無Ca2+、Mg2+液體(D-Hanks液)1000ml
4.磁力攪拌混勻,使其完全溶解
5.過濾、除菌、分裝備用
6.D-Hanks液
7.準確稱量NaCl 8.00g、KCl 0.40g、Na2HPO4.H2O 0.06g、KH2PO4 0.06g、NaHCO30.35g;
8.依次將各成分溶解於800ml三蒸水中。溶解時必須待一種試劑完全溶解後,再加入 下一種試劑,直至所有試劑溶解後混勻;
9.酚紅用5.6%NaHCO3將之溶解;
10.補加水至1000ml混勻;
11.分裝鹽水瓶內,8磅10~20min高壓蒸汽消毒滅菌,4℃冰箱內保存備用。
12.用水配製7.4% NaHCO3溶液,過濾除菌,分裝備用;
13.用無菌NaHCO3溶液調節Hanks液pH值7.2~7.4。
14.以去離子水稀釋DNA酶Ⅰ至200 u/ml,過濾除菌備用。
15.90%Percoll: (9份Percoll:1份9.0% NaCl)
16.DMEM-H-G:(DMEM培養液、25mM HEPES、25mM葡萄糖)
17.台盼藍液:稱取4g台盼藍,加少量蒸餾水研磨,加雙蒸水至100ml,用濾紙過濾,4℃冰箱內保存備用,使用時以PBS稀釋至0.4%。
二、滋養層細胞分離純化實驗方法
取剖腹產術後的無菌胎盤組織,在無菌條件下剪取蛻膜層與羊膜層之間的絨毛組織,以無菌生理鹽水反復洗滌三次,修剪以去掉連接的組織、血管等得到柔軟的絨毛,大約30g。將絨毛組織剪碎至1~3mm3,並盡可能去除肉眼可見的小血管及纖維連接成分。
1.胰蛋白酶消化
將絨毛剪碎至2~3mm3左右的小塊;
100mL 0.25%胰蛋白酶、15U/ml DNA酶Ⅰ37℃消化30min,每隔5~10min搖動一次;
(吹打)消化產物,(吸取消化液)經100目不銹鋼篩網過濾後,濾液加入50ml離心管內(加入10%FCS),1000rpm/min離心5min,棄上清;
以含20%胎牛血清DMEM培養液重懸沉澱;(37℃孵箱中)
2.未消化組織重複消化兩次;
收集三次細胞懸液,調整細胞濃度至1×106/ml(不必非常嚴格,只要不是過少),鏡下檢查細胞呈單個細胞分佈。
此時可接種至培養瓶中培養,如果有細胞成活繼續以下實驗,便於分析原因。
3.Percoll等密度梯度沉降法分離得到純滋養層細胞
製備密度梯度 用9.0%NaCl與Percoll以1:9混合,以達到生理性滲透壓,再以0.9%NaCl稀釋為45%和35%兩個濃度,按濃度從大到小將兩個不同密度的Percoll溶液逐層緩慢加入10ml離心管內,每個濃度3ml。
加樣 用吸管吸取3ml細胞懸液(含4×107個細胞-----不必非常嚴格),小心加在10ml離心管頂層的分離介質上面。
分離 室溫下以2500r/min離心20min
離心後分為3部分 底層為RBC、少量多形核WBC,頂層為組織連接成分、小血管、絨毛碎片,中層為相對一致的單個核細胞
收集 用吸管吸取雲霧狀的中層置於一50ml離心管內,DMEM稀釋4倍,1000rpm/min離心10min,棄上清,以含20%胎牛血清、100u/ml慶大黴素、25mMol/L HEPES的高糖型DMEM培養液重懸沉澱。
4.細胞培養
將所得的細胞懸液濃度調整至5~6×105/ml,置於培養瓶或預先置有蓋破片的六孔培養板內37℃,5%CO2孵箱內培養。每24h更換培養液1次。(第一次換液時用培養液洗兩次,以去除細胞碎片、內源激素;換液之前在倒置相差顯微鏡下檢查細胞貼壁和細胞形態。)
細胞活力檢測(台盼藍排斥試驗)